尺寸排阻色谱柱是一种广泛应用于生物分析领域的工具,其工作原理主要基于分子大小差异进行分离。利用柱内固定相中孔隙与分子间的物理作用来实现分离。具体来说,聚合物分子在柱子中的孔道中被筛选,较大的分子无法通过尺寸较小的孔道,只有较小的分子才能通过这些孔道,从而实现不同分子尺寸的分离。其优点在于其分离速度快、操作简单、分离效果好。此外,该技术不依赖于分子之间的亲和性或化学性质,因此适用于各种生物大分子,如蛋白质、多肽和核酸等的分离。
尺寸排阻色谱柱在使用过程中可能会遇到以下一些常见问题:
1、柱效与峰形问题
柱效下降:可能是由于样品与流动相未过滤,杂质堵塞柱子导致。若出现此现象,需用合适的溶剂冲洗柱子,如参考说明书、操作手册等文件进行冲洗操作。另外,若使用的流动相含有有机溶剂,也可能导致柱效下降。
峰形异常:包括峰型变宽、分岔、分离度下降等。这可能是进样量超过柱体积的5%,或样品浓度过高、粘度大,使样品无法以同一速度通过色谱柱,产生“指形效应”。此时应控制进样量和样品浓度,保证样品粘度与流动相一致。
出现鬼峰:若不是溶剂与流动相差异导致的基线波动,需通过排除法,如进空白溶剂、换柱子等,找到杂峰、鬼峰的来源并解决。
毛刺峰:通常是柱身中进了空气所致,可通过长时间低流速的流动相冲洗去除气泡。
2、保留时间漂移问题
流动相因素:若流速稳定,可能是流动相未完q混匀,导致洗脱强度不断变化从而使保留时间漂移。需确保流动相充分混合均匀后再进行分析。
系统故障:若流速和压力不稳定,可能是仪器泵液系统产生漏液、故障等问题,需要实际排查修复。
3、色谱柱堵塞与柱压问题
柱头筛板堵塞:如果柱头筛板处堵塞导致柱压接近柱压上限,可以通过反向冲洗色谱柱来解决,但要注意将流出液体直接排至废液桶防止二次污染。常规的由杂质吸附填料引起的压力升高,可通过正向冲洗掉杂质来解决。
压力超限:可能超过了色谱柱的最大耐压,导致填料被压实或损坏,影响分离效果和柱寿命。应立即降低压力,检查并更换受损部件。
4、使用寿命问题
杂质影响:样品和流动相中的杂质会堵塞柱子,缩短其寿命。因此样品与流动相进样前必须过滤,流动相建议现配现用。
使用不当:如在不适当的pH值、缓冲液种类或盐浓度下操作,以及在极d温度或压力条件下使用等,都可能损害色谱柱。应严格按照操作规程使用和维护色谱柱。
5、溶剂相关问题
溶剂不匹配:样品溶剂与流动相的不一致可能会导致不同程度的干扰,严重时会影响分离效果。一般要求溶剂与流动相完q一致,或通过稀释尽量保持接近。